成功轉染**步：細胞培養注意事項
細胞系的選擇通常不是我們說了算的。有時是實驗的需要，有時是實驗室條件的限制。如果有選擇的余地當然挑個容易做的。越是接近體內的真實情況的原代細胞，通常越是難于伺候。反之亦然。此外細胞本身的特性也是需要考慮的因素。有時需要根據細胞系來選擇合適的轉染方法;而有時一些啟動子在不同的細胞系中表現的功能也不同。這些都是設計實驗時需要考慮的因素，姑且不論。不過因為受限于特定的細胞，如何選擇合適的轉染方法就值得考究了。因為不同的細胞可能適用不同的轉染試劑和轉染條件。如果實驗室已經建立了全套方法，照做可也。如果是個新來的細胞株，好查查資料看哪些成功轉染案例。每種轉染試劑都會提供一些已經成功轉染的細胞株列表和文獻，看看其中是否有你的新對手——這個FuGENE 6 比較有優勢，已有750多種細胞系成功轉染的資料可供參考。聚焦轉染專輯里面也一一列出查閱各主流轉染試劑相關數據的網址。當然這只是參考而已，細胞培養在實驗室中保存數月和數年后會經歷突變，總染色體重組或基因調控變化等而演化。這會導致和轉染相關的細胞行為的變化。
當實驗進行到轉染這一步時需要注意的因素有哪些呢?
一、健康而茁壯成長的細胞
轉染前細胞好經過1—2次傳代，以保證細胞生長旺盛，容易轉染。注意，貼壁細胞生長到幾乎匯片時就要趕快進行下一次傳代，千萬不要使細胞保持融合超過24小時，因為一旦長滿了，細胞們就“故步自封”不思轉染啦。活力充沛的年輕細胞更容易接受外來的新鮮事物嘛。
大多數已建立的細胞系都是非整倍體，細胞培養在實驗室中保存數月和數年后會經歷突變，總染色體重組或基因調控變化等而演化，這會導致和轉染相關的細胞行為的變化。如果隨時間發現這種變化，融化一管新鮮的細胞可能會恢復原先的轉染活性。比如，新鮮融化的NIH 3T3細胞比傳代8次的細胞表現出更高的轉染效率(融化細胞的進一步傳代不會馬上降低轉染效率)。因此，如果觀察到轉染效率降低，可以試著轉染新鮮培養的細胞以恢復佳結果。
二、恰到好處的鋪板密度
轉染時的細胞密度對轉染效率影響非常顯著。不同的轉染試劑，要求轉染時的適細胞密度各不相同，即使同一種試劑，也會因不同的細胞類型或應用而異。轉染時過高或者過低的細胞密度會導致轉染效率降低，乃至表達水平偏低。因此如果選用新的細胞系或者新的轉染試劑，好能夠進行優化實驗并為以后的實驗建立一個穩定方法，包括適當的接種量和培養時間等等。一般轉染時貼壁細胞密度為40%-80%，但這個需要參考所選轉染試劑的說明書——陽離子脂質體具有微量的細胞毒性而往往需要更高的鋪板密度或者更多的懸浮細胞數，有的要求細胞90%匯片;而有些多胺或者非脂質體的配方則要求在40%—80%之間，總之是盡量在細胞適的生理狀態下轉染，以求佳的轉染效果。
不同的實驗目的也會影響轉染時的鋪板密度，比如研究細胞周期相關基因等表達周期長的基因，就需要較低的鋪板密度，所以需要選擇能夠在較低鋪板密度下進行轉染的試劑。需要特別注意。
三、溫暖舒適的培養基
健康的細胞培養是一切成功轉染的基礎。不同的細胞類型有不同的特性，需要特定的培養基、血清、補充添加劑等等。如果是培養新手，可留意隨后的生物通細胞培養專輯，我們就不羅嗦了。還是專心介紹幾種添加劑在轉染過程中“影響因子”吧。
血清
血清一度曾被認為會降低轉染效率，老一代的轉染方法往往要求轉染前后洗細胞或者在無血清培養基條件下轉染，對于某些對血清要求敏感的細胞來說是個難題。不過轉染產品配方幾經革新后的今天，對于主流的轉染試劑來說，血清的存在已經不會影響轉染效率，甚至還有助于提高轉染效率，比如FuGENE6、Effectene和GeneJuice等。對于多數可以在有血清條件下工作的轉染試劑來說，血清的存在會影響DNA—轉染復合物的形成，但只要在DNA-轉染復合物形成時用無血清培養基來稀釋DNA 和轉染試劑就可以了，在轉染過程中是可以使用血清的。這些方便好用、可在有血清條件下轉染的試劑包括前面介紹的 Lipofectamine2000，FuGENE 6，GeneJuice，Effectene，Polyfect等等(看看生物通前面的介紹吧)。厲害的是Qiagen的2個產品，Polyfect和 Effectene，全程都可以用有血清和***等添加劑的完全培養基來操作，包括稀釋步驟，不用擔心培養基的變化對細胞生長有什么**影響了。這樣，就不再需要在轉染前多次洗細胞，也就減少操作的復雜程度，更重要的是不必再讓細胞處于無血清的“悲慘環境”中轉染，不必擔心對血清缺乏很敏感的細胞受到不必要的麻煩了。嬌貴的細胞們，你們有福了。不過要特別注意：對于RNA轉染，如何消除血清中潛在的RNase污染是值得關注的。所以血清的質量也是需要關注的。新加培養基的預熱對細胞轉染很有幫助。
***
支原體、**、**污染，無論對于細胞培養或者轉染都是“不堪回首的痛”，可能會嚴重影響轉染結果，細胞培養過程中往往會添加***來防止污染。但是這些添加劑可能對轉染造成麻煩。比如青霉素和鏈霉素，就是影響轉染的培養基添加物。這些***一般對于真核細胞無毒，但陽離子脂質體試劑增加了細胞的通透性，使***可以進入細胞。這可能間接導致細胞死亡，造成轉染效率低。所以，對于選擇Lipofectamine2000系列轉染試劑的實驗，要特別注意在轉染培養基中不能使用***，甚至在準備轉染前進行細胞鋪板時也要避免使用***。這樣，在轉染前也不必潤洗細胞。對于穩定轉染，不要在選擇性培養基中使用青霉素和鏈霉素，因為這些***是GENETICIN選擇性***的競爭性抑制劑。另外，為了保證無血清培養基中細胞的健康生長，使用比含血清培養基更少的***量。這里又要表揚 Qiagen的2個產品，Polyfect和Effectene，因為全程都可以用有血清和***等添加劑的完全培養基來操作，很方便的。對于篩選穩定表達株，要預留足夠的時間讓抗性基因表達后再添加篩選壓力。
其他添加物如***，EDTA，檸檬酸鹽，磷酸鹽，RPMI，硫酸軟骨素，透明質酸，硫酸葡聚糖或其他硫酸蛋白多糖這些物質的存在可能會干擾DNA和轉染試劑形成復合物的過程，要盡量避免。
成功轉染**步：質粒DNA轉染
一、質粒的構建：啟動子的選擇
啟動子的選擇對于轉染基因的有效表達是非常重要的。對于轉染過程本身雖然無甚影響，但是對轉染結果卻有著微妙的影響。
啟動子可分為2大類：誘導型啟動子是比較精明的，平時歇著，一旦接到誘導信號指示就馬上開工干活兒。而組成型啟動子比較老實的，就是從頭到尾不停干活從不閑著的那種——比如我們很熟悉的CMV啟動子啊，SV40啊，pMC1啊，PGK啟動子啊等等。
獲得高轉染活性所需選擇的啟動子依賴于選用的細胞系和要表達的蛋白。CMV啟動子在大多數細胞類型中可以獲得高表達活性。在BHK-21中，CMV啟動子活性比其他啟動子如SV40和RSV都要高。但這三種病毒啟動子在T細胞來源的細胞系，如Jurkat中組成表達水平較低。轉染后在培養基中加入PHA- L和PMA可以激活Jurkat細胞中CMV啟動子，而單PMA就足以激活KG1和K562(人骨髓瘤白細胞)中的CMV啟動子。SV40啟動子的表達在含有大T抗原(存在于COS-1和COS-7)時會提高，因為大T抗原可以刺激染色體外的合成。
一個強悍的高表達組成型啟動子是我們做表達所求之不得的，但是對于轉染本身來說卻不一定好——因為任何持續過高表達外源基因都可能帶來某種程度的細胞毒性，影響細胞生長——如果外源基因本身對細胞生長有毒，那更完蛋了，你很可能篩不到轉染成功的細胞株，更別提穩定轉染了——因為過量表達本身可能已經害死了那個轉染了的細胞，沒轉染的細胞又死于篩選壓力。這種時候一個不那么“能干”的啟動子可能更適合一些。如果你曾經遇到原因不明的轉染失敗案例，會不會是這個原因呢?過猶不及就是這個道理咯。
誘導型啟動子對于轉染來說，特別是穩定轉染，可能是更好的選擇。它使得目的基因的表達可以受到我們的調控——轉染的時候不表達，篩選穩定表達株后再誘導表達，使得表達有毒性的基因或者**分析表達產物的生物學效應成為可能。多數誘導型啟動子在接受某種信號后“打開開關”開始工作，也有的相反，在缺失某種信號后打開開關。Clontech還有個誘導系統是“劑量依賴的”，就是說不單表達開關可控，表達量多少也可以通過誘導劑的量來調控。還有一種特殊的啟動子很好玩——具有時序性或者組織特異性(空間特異性)，會受到特定的元件調控，在一定的時間或者特定組織細胞中表達的，比如那個轉基因山羊奶里用的只在泌乳期的乳腺細胞中表達的啟動子——有人說這是組成型的，我覺得應該是誘導型的，只不過誘導的因素我們不知道罷了，這類啟動子在不同的細胞中會有不同的表現，需要注意。誘導系統的問題主要是本底表達，表達量有限，以及誘導劑本身對細胞的影響和如何**，不過這些都不關轉染的事，我們等生物通的表達專輯時再慢慢說吧。
轉染DNA的啟動子-增強子如果不被宿主細胞識別也會產生無法表達的“悲劇”，這是實驗設計時需要注意的問題。不過現在利用現成試劑盒或者模擬國外已經成功的實驗的居多，獨立構建表達系統的極少，因而這種問題遇到的幾率也幾乎可以忽略不計。
目的基因：這個對于研究人員來說是目的，因而沒有選擇的余地。如果你的目的基因正好會影響選定細胞株的生長，甚至有毒，那好選擇一個誘導型的啟動子，不然你可能總是轉染不了。但是通常在實驗之前我們不清楚我們研究的基因產物是否對選定的細胞有毒，所以正負對照很重要。當排除其他原因后轉染總是失敗，應當從根本上考慮原因。
二、質粒的大小和質量 線性化還是超螺旋會影響轉染結果：超螺旋質粒的轉染效率比線性DNA高得多，特別是瞬時轉染。而線性化DNA轉染的整合幾率高。質粒太大了轉染會困難一些。畢竟，相對致密、較小的外源異物被細胞內吞的幾率要大一些。如果你的質粒正好比較大，又沒有經驗，選擇特別注明可以轉大質粒的轉染試劑成功幾率會高一些。有的轉染試劑還會提供一些促進DNA凝聚的成分，使得DNA形成轉染復合物時更致密一些，更容易轉染一些。
純化質粒的質量無疑會影響轉染效率。哺乳動物細胞總歸是比大腸桿菌嬌氣，轉染難度高些，因而要求的DNA純度要更高些。早年要做轉染真是大陣仗啊，光是提質粒做超離就令人皺眉。令人頭疼的是內**了。內**是革蘭氏陰性菌細胞壁上特有的成分，主要是脂多糖中的類脂A(lipopolysaccharides)，在**被裂解時被釋放出來，由于其化學結構和特性，在質粒提取的過程中內**很容易混入質粒DNA**同純化出來。內**的存在會嚴重地影響轉染效率，此外內**可能會激活造血細胞(例如B細胞、巨嗜細胞等)的非特異**反應，造成實驗中的假陽性。所以質粒DNA轉染時應盡量采用無內**污染的超純質粒。幸好技術的進步令復雜的操作成為過去，多數實驗室會選擇使用轉染級別的質粒純化試劑盒純化的質粒來轉染。對于一些“耐受性高、容易操作的”細胞株，普通的Kit已經夠了。對于一些對內**特別敏感的細胞，就要用“去內**”的質粒純化Kit了。Qiagen的Endofree系列可以得到相當于2次CsCl超速離心純度的質粒，同時特別設計去除內**，專為嬌氣的細胞系轉染和體內DNA疫苗而設計。此外現在Invitrogen和Stratagene都有一些快速純化質粒同時也去內**的Kit，使得去除質粒中的內**更為簡便(參考生物通質粒純化專輯)。
質粒DNA的濃度和量：既然質粒純化已經不成問題，初學者通常都不會在乎甚至愿意多加點DNA，但是要注意的是，DNA量過少固然轉染效率不高，DNA量過多同樣會降低轉染效率。有的初學者習慣按照說明書123地去操作而不求甚解，你“知其然”是否還“知其所以然”呢?DNA:轉染試劑的比例的優化是非常重要的，特別是對于陽離子脂質體、多胺等帶電荷的轉染試劑來說，DNA-轉染復合物所帶的凈電荷是由轉染試劑和DNA的比例決定的，而轉染復合物是否能更好地結合到帶負電的細胞膜上，很大程度取決于這個凈電荷。所以預實驗需要按照說明書的要求，按一定比例混合適量的質粒DNA和轉染試劑。有的轉染試劑要求DNA的量多些，有的轉染試劑效率高只要很少DNA，比如Effectene只需要常規五分之一的DNA。所以轉染前好能**定量質粒。另外由于質粒本身的因素(比如目的基因產物是否有毒、啟動子強弱等因素)，單獨DNA也會對細胞生長有一個基礎的影響，所以同時做幾組不同量的對照實驗進行優化是很有幫助的。另外值得注意的是，當細胞鋪板密度較高時，需要的質粒DNA和轉染試劑的量也會略微提高。
