目前，國外許多制藥企業對高內涵篩選表現出濃厚的興趣，全球有數百家新藥研究機構啟動了這一領域的研究項目。國外業界人士認為，高內涵篩選不僅能闡明被篩樣品與藥靶的相互作用關系，而且可同時了解細胞的其他生物學改變，進而研究其對相關代謝途徑的影響，并通過觀察細胞形態來預測化合物的毒性。在這樣的要求和技術的發展下，要怎樣進行高內涵細胞水平的篩選成了關鍵性的問題。

什么是高內涵細胞篩選

所謂高內涵篩選(high content screening，HCS; 或high content analysis，HCA)是指在保持細胞結構和功能完整性的前提下，同時檢測樣品對細胞形態、生長、分化、遷移、凋亡、代謝途徑及信號轉導各個環節的影響，確定其生物活性和潛在毒性。在活細胞自然條件下研究蛋白質功能可以比較準確地了解其生物學特性(如在細胞內的分布轉運、表達調控和信號轉導等)，而新近發展的光學顯微技術(尤其是顯微熒光定量方法)和與之配套的計算機圖像處理及數據分析軟件已成為這類研究的基本手段。高內涵篩選分析正是基于上述科學技術進步而產生的一種全新的新藥研究手段。與分子水平篩選相比，細胞水平的篩選免去了對靶標蛋白的純化，使靶標蛋白的構象及所處的環境更接近天然的生理狀態，同時那些具有細胞毒性和/或不能透過細胞膜的化合物將被排除。

高內涵篩選的原理

高內涵篩選的儀器一般由白色連續光源、多通道濾光片(適于常用的熒光染料)、顯微鏡模塊和高速高分辨率的CCD照相機進行圖像的獲取，同時還可以配備細胞培養和自動加樣模塊進行長時間全自動的實驗分析?；诩す獾挠布劢瓜到y使得自動對焦在200ms之內，再結合軟件聚焦，完善了對拍攝對象的快速定位和圖像獲取。除了圖像獲取部分外，圖像采集、圖像分析和數據儲存也是高內涵**篩選設備的主要組成部分。其中用于圖像分析的應用軟件大致可以分為兩種：一種是針對某類特定生物學反應而設計的專用分析模塊，研究人員能夠在一定程度上通過修改參數來適應檢測精度的需要，另一種為使用者可以根據實驗和檢測要求自己來設計軟件(客戶自定義軟件),如GE 公司的Developer Toolbox, 是目前全球**一個可以允許用戶根據自己細胞系的特點自行創建分析方法，并對細胞圖像進行更深層次的區域劃分和定義，獲得真正量身定做的分析結果的軟件，并在2006 年獲得美國《Scientific Computing》雜志授予的“年度佳生物圖像分析軟件獎”。 實施高內涵分析在單位時間里會產生和采集數以萬計的圖像，必須及時處理和妥善保存。一個完整的高內涵篩選技術系統應該包括具有一定開放性的數據存儲庫，對不同來源的實驗數據進行統一的分析和管理，同時允許研究人員調取信息，分析研究。

運用高內涵技術進行**篩選和毒性評估

目前高內涵篩選技術的應用已經從功能鑒定逐漸拓展到靶點發現、靶點驗證、活性初篩、代謝及毒理等研究領域，顯示了巨大的發展潛力。主要的檢測范圍包括：靶點激活、細胞凋亡、分裂指數、蛋白轉位、細胞活力、細胞遷移、受體內化、核質或者質膜轉位、細胞毒性、細胞周期和信號轉導等，細分下來可以檢測上百種細胞參數指標，其應用幾乎涵蓋細胞分析的所有方面。下面通過實例來說明高內涵篩選技術在新藥開發和**毒性評估中的強大應用。

建立針對高爾基復合體的藥篩模型

高爾基復合體作為細胞內的分泌途徑參與到了相應外界刺激中，并且可能根據刺激信號的不同程度來激活修復或者相反的凋亡機制，目前已經被認為是可能的癌癥研究和**的**靶點。目前已經有一些化合物被證明能夠引起高爾基復合體的形態變化，因此開發一種能夠展示高爾基復合體在不同環境下的多參數形態和組分變化的方法，將對針對其的**開發提供巨大的幫助。運用高內涵分析結合多種高爾基組分特異熒光標記能夠快速得到極高分辨率的展示高爾基特性的圖片。

在下圖的方法中，特異compartment標記用來區分cis-Golgi和trans-Golgi network (TGN)，并且利用軟件獲得定量的定位(比如分布和數目)和形態(比如大小)等結果從而檢測化合物的活性。在這種方法里，圖像的質量和精度必須達到一定的程度才能細致的區分不同結構。除了使用高NA值的高倍鏡頭外，利用軟件進行圖像復原也可以達到提高細節分辨率的效果。下圖中使用了2D去卷積模式，大大提高了圖像尤其是標記物的邊界的對比度和精度，從而保證正確的劃分和分析。利用高質量和高通量的圖像分析高爾基復合體在不同化合物作用下的結構以及細胞活性從而使得用于篩選促進和拮抗**的高通量藥篩模型得以實現。。

Nocodazole處理后的cis-Golgi和trans-Golgi network (TGN)的共定位分析

圖片使用GE Healthcare的IN CELL 2000高內涵成像儀在40×/0.6 NA 物鏡下使用2D去卷積模式拍攝。HeLa細胞使用1.85 μM nocodazole處理4小時后染色拍攝。細胞核(藍色);cis-Golgi(綠色);TGN(紅色);共定位信號為黃色。

細胞毒性分析

**研發過程中，如果在晚期才發現**的毒副作用會顯著增加項目成本，推遲上市時間，甚至上市后才發現比如心臟毒性造成健康威脅將會面臨撤市，造成巨大的經濟損失和社會危害。當前已經實現高通量化的細胞毒性檢測技術主要分為兩類：a)基于線粒體活性的方法，如MTT法、Alamar Blue法和ATP生物發光法等;b)基于細胞膜通透性的熒光染色法，如Propidium iodide等。隨著對細胞凋亡通路的不斷認識，通過不同熒光標記技術判斷和區分細胞死亡和凋亡與壞死細胞毒性檢測方法已越來越普遍。

雖然熒光顯微鏡或流式細胞儀配合上述適當的熒光染料是區分凋亡或壞死常用的手段。高內涵篩選方法使實現熒光染色檢測細胞凋亡高通量化成為可能。高內涵分析是全自動活細胞分析系統, 其全自動位移,全自動聚焦, 高速圖像獲取和全自動軟件圖像分析是共聚焦顯微鏡無法比擬的，尤其是利用應用軟件, 可以通過對不同檢測指標展開組合來分析細胞毒性。2011年GE healthcare又推出了基于共聚焦系統的高內涵分析系統IN CELL 6000搭載獨有的可變的共聚焦光闌，大大提高了圖像質量。流式細胞儀是對DNA 進行熒光探針標記，在高速細胞液流從噴嘴噴出時對熒光信號進行檢測并計算細胞相關參數，并不需要成像。高內涵分析系統采用的是96 或384 孔板多樣品平行數據采集和分析，在樣品多時有著明顯優勢，分析時間要比需要單個樣品逐個處理的流式細胞儀快數百倍。同時基于圖像的分析可以對終結果進行原始圖像的追述，大大提高結果的可靠性。

上述高內涵實驗技術經過短短數年的發展已經逐步整合到高通量**篩選的實踐中，并且在儀器制造、圖像處理和運轉速效等方面都有了進一步的提高。標記分子、常用試劑的開發也逐漸超越GFP和現有的熒光染料，以便開展更多的活細胞實時檢測。高內涵篩選分析軟件更是在數據分析和結果判定方面舉足輕重, 在**篩選中起到越來越大的作用。細胞水平高內涵**篩選和**毒性篩選越來越成為新藥創制過程中不可或缺的技術選擇。（生物幫bio1000.com）